實驗?zāi)康?/strong>
對果蠅進行研磨,提取其RNA。
實驗原理
通過研磨珠的撞擊,充分研磨果蠅,進而提取其RNA。
實驗材料和器具
樣品:果蠅
儀器:高通量組織研磨儀(上海凈信,Tissuelyser-24)
耗材:離心管,不銹鋼研磨珠(上海凈信,6號)
實驗步驟
1.取5-10只果蠅放入研磨管中,蓋緊研磨管. 加入研磨珠,13單位振頻,1min,充分勻漿(時間可根據(jù)樣品本身的難易程度來調(diào)節(jié),難磨的樣品,可以延長時間,如一次運動兩分鐘還不是很充分,可以間隙的重復(fù)工作幾次)
2.將研磨管放入高通量組織研磨儀中,60M/S研磨30S
3.機器停止后,取出研磨管,放入冷凍離心機中,于4度,10000g離心10分鐘
4.小心吸取上清液0.1研磨單位至新的0.3研磨單位離心管中,蓋上管蓋,在室溫上孵育15分種,使樣品充分裂解至勻漿液較透明,如果仍有少量顆粒屬于正常情況,不影響RNA提取質(zhì)量和得率。
5.在0.3ML離心管中加入0.02研磨單位氯仿,蓋緊管蓋,振蕩混勻并將其在冰上孵育15分種,于4度,12000g離心15分鐘。離心后混合物分層:上清層,中間層,下層;RNA存在于上清層中。
6.將上清層小心轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中,加入等體積冰浴的異丙醇,顛倒振蕩混勻,將混合的樣品在-20度條件,孵育20分種,于4度,12000g離心10分鐘。RNA沉淀通常形成片狀沉淀附著于管壁或管底。
7.小心棄去上清,用0.2體積的冰浴75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次,顛倒洗滌離心管管壁,并旋渦振蕩樣品,盡可能讓沉懸浮,于4度,12000g離心5分鐘,再次去除上清,晾干沉淀。
8.操作的最后,在陰涼處適度干燥RNA沉淀(避免過分干燥,那樣會降底它的可溶性)。
9.用適量(一般可用0.01—0.02研磨單位)的無RNA酶水或TE溶液來溶解RNA。抽提好的RNA,保存于-70度。