(還可以提取如沉積物,排泄物,廢水,雪水等樣品的DNA)土壤微生物基因組DNA抽提試劑盒/提取試劑盒
(利用硅吸附DNA原理)
一,說明
本試劑盒可以在30分鐘內(nèi)快速有效的直接從土壤分離微生物基因組DNA。用上海凈信科技(全自動樣品快速勻漿機)FSTPRP儀器(將樣品與緩沖液加入帶有特殊小珠的樣品管/離心管)在40秒內(nèi)可以裂解土壤中的植物、動物組織、細菌、藻類、真菌孢子、酵母、線蟲。經(jīng)過本試劑盒的分離純化,所得的DNA可以用于PCR、限制性酶切、電泳和其他使用。
濃縮SEWS-M使用前加入25ML無水乙醇,并在瓶子上做好標記,蓋好瓶蓋
WASH D使用前加入56ML無水乙醇,并在瓶子上做好標記,蓋好瓶蓋
用1ML ddH20(滅菌)完全溶解RNA酶,將RNA酶放入水中煮,水沸后再煮沸20分種,并掉炎,緩慢冷至室溫后,將RNA酶取出,全部加入 sodium phosphate buffer中,充分混勻后,將sodium phosphate buffer buffer 放入4度保存。
試劑盒組成
二,步驟
加入500MG 土壤樣品到一個樣品管中,管中應管有0.05-0.1ml 空間。
(注意一,為使樣品盡可能遙多均勻,一個樣品一般取四個管,兩管并一管,得到兩管的DNA,注意二,在試驗中,可用普通離心管+氧化鋯珠(0.8g),注意三,應將放在-20度的樣品上一天取出化凍)
加入0.1956ml sodium phosphate buffer 到樣品中
加入0.0244ml MT buffer 到樣品中
用上海凈信科技(全自動樣品快速研磨機機)儀器以速度14單位頻振60S 反復三次(確保完全可以粉碎)
13000rmp 離心5-10min ,沉淀碎片 (注意一,加一步去除腐酸的步驟:取上清到10研磨單位離心管,加入。。。。。。。。。。。。。顛倒混勻,2MIN 12005MIN看不清)
將上清(約0.12ml)轉(zhuǎn)移到一個干凈的2研磨單位離心管中,加入0.05ml PPS到管中,用手顛倒混勻10次。
13000RPM 離心5MIN 以沉淀蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移上清到一個干凈的2研磨單位離心管中(約0.14ml)
加入1ML Binding solution b(5倍體積)到2研磨單位離心管中,用手顛倒混勻2MIN (提前水加熱,促進DNA與硅膠給合)
將結(jié)全柱放入2ML收集管中,凈混合液加入結(jié)合柱中,室溫放置2 min.(分三次加,每次加0.12-0.14ml兩管并一管)
13000RPM離心1MIN,倒掉收集管中的廢液,將結(jié)合柱重新放入2研磨單位離心管中。
加入0.1ml SEWS-M(Spin-buffer)到結(jié)合柱中,13000RPM離心1MIN,倒掉收集管中的廢液。
注去注腐殖酸
在1.5研磨單位離心管中制備腐殖酸洗滌溶液:
Sodium phosphate buffer 978UL
MT buffer 0.0244ml
Pps: 250ul
混勻,13000RPM離心1分種轉(zhuǎn)移上清液于一個干凈的2研磨單位離心管中。
加入等體積的5M Guanidine Thiocyanate sojution 混勻。
加入0.1ml 腐殖酸洗滌液到步聚11中的結(jié)合術(shù)中,13000RPM離心1分種,倒掉收集管中廢液。
重復上述步驟三次
接步驟十二
加入0.13mlwashD 于結(jié)合柱中,13000RPM離心1MIN,倒掉收集管中的廢液。
將結(jié)合柱裝入離心管中,130000RMP離心2MIN
將結(jié)合柱裝入1.5研磨單位離心管中。室溫放置五分種,以便乙醇揮發(fā)干凈,在膜中央小心加入,0.015ml DES 。不要戳破膜,室溫放置2MIN。(37度 30MIN)
13000RPM離心1MIN 離心管中即為分離的DNA,貯存于-20度或進入下一步室實驗。(應將2管DNA混于一管,混勻,再分成兩管,這樣即能得到4管一管的目的。目的是盡量消除樣品內(nèi)部差異)
本實驗不用去除腐殖酸這一步,但有文獻指出,在-20度時,腐殖酸仍會降解DNA,